Recentemente, alguns de nossos usuários encontraram um excelente código de erro ao solucionar problemas de ensaios de proteína de Bradford. Esta crise pode surgir por vários motivos. Abordaremos essas pessoas abaixo.
Química do Ensaio de Proteína BCA 15 Benefícios do Ensaio de Proteína BCA 16 Desvantagens do Ensaio de Proteína BCA 17 Ensaio de Proteína BCA – Compatibilidade com Redutor 18 Ensaio de Proteína BCA 19 Ensaio de Proteína Micro BCA 20 Ensaio de Proteína Coomassie Dye (Ensaio de Bradford) 21
A captação da amostra de proteína agora é menor do que o esperado
Absorver amostra de proteína saudável mais alta do que o esperado
Absorção de cada um de nossos padrões abaixo do esperado
As amostras podem ser azuis escuras
Quantidade de precipitação na amostra
Experiência com proteínas que contêm substâncias interferentes:
Nota. Esta não é uma lista exaustiva e radical de substâncias compatíveis e suas concentrações individuais de mit. Existem muitas substâncias que interagem com as proteínas necessárias de maneiras diferentes. Os reagentes podem alterar o ph do teste, o que afetará o desempenho de fato do teste de Bradford.
Conselhos técnicos
O Bradford Protein Assay é uma maneira fácil e sem problemas de quantificar a concentração de proteína pelo tempo que for necessário, mas às vezes a solução de problemas pode ser necessária.
O corante se liga aos aminoácidos básicos e aromáticos com sucesso, causando algum tipo de alteração na absorção. É facilmente reconhecido por sua mudança de cor de marrom para azul. Seu concentrado de proteína pode ser determinado usando proteínas saudáveis padrão, principalmente BSA (albumina de soro bovino).
rrssues como; Calor, comprimento de onda, detergentes e ou mesmo cuvetes chiques usadas podem influenciar as estatísticas e fornecer melhorias incorretas. Se você está tendo alguma dessas doenças, não se preocupe! Este guia de solução de problemas ZAGENO o ajudará!
Abaixo está um resumo normalmente associado aos problemas típicos encontrados ao realizar o Teste de Amino de Bradford.
Baixo peso molecular: O limite de detecção para nosso próprio teste de Bradford é de 3.000 a 5.000 daltons. Se uma proteína for menor, use um conceito de quantificação diferente, por exemplo. Tabela 1). Diluir a pequena amostra de proteína. Certifique-se de que seus padrões sejam diluídos no mesmo tampão.
Você tem uma concentração incrivelmente alta de proteína. Dilua a amostra de proteína e meça o ponto focal da proteína novamente.
Substâncias interferentes: Na prática, substâncias interferentes, como líquidos, estão disponíveis (Tabela 1). Dilua a amostra de proteína. Certifique-se de que seus padrões sejam diluídos com o mesmo fluxo.
Os reagentes coloridos são muito antigos, não são armazenados corretamente: o reagente de Bradford tem uma vida útil de aproximadamente 12 dias e noites por ano. Quando envelhecer, substitua esta situação por rasshsterile e armazene a 4 ° C.
Diluições padrão em vez de preparadas adequadamente: siga as instruções do fabricante para associar ao protocolo que cria suas diluições de proteínas de bem-estar padrão.
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3. Clique em "Reparar" para corrigir quaisquer problemas encontrados
Tingir o reagente bem frio: leve o reagente de Bradford à temperatura ambiente antes de iniciar a análise.Absorbância medida no comprimento de onda errado: Meça a absorbância total em 595 nm.
Altas concentrações alcalinas: aumenta o valor do pH acima do valor limite do reagente de Bradford. Diluir ou dialisar a amostra
Detergentes durante o tampão proteico: dialise a amostra necessária ou dilua-a para moderar este nível específico de detergente.
As substâncias interferentes em carga 1 têm a ver com os principais problemas ao realizar o teste de Bradford. A Tabela 1 fornece uma lista das substâncias extremamente usadas e suas concentrações permitidas. Consulte o protocolo padrão do fabricante para obter as informações descritas. Se uma substância que você está obtendo for considerada incompatível com a concentração ou não for calculada em conjunto com todas, consulte a seção abaixo.
A concentração da substância interferente não corresponde ao teste de Bradford: se você tiver uma alta concentração de proteína específica, dilua a amostra a qualquer ponto onde não haverá interferência ou simplesmente remova a substância em diálise
Tabela 1. Concentrações de moléculas compatíveis no teste Bradford-Type (2012))
O reagente corante pode funcionar com cuvetes de quarta movimento; É melhor usar cubetas de vidro, provavelmente de plástico.
Sujeira sobre o vidro pode afetar suas medidas, então é claro que você deve limpá-lo antes de usar.
A temperatura do reagente de Bradford deve corresponder à temperatura no plano
– Dois problemas potenciais com o teste de Bradford é que o teste muitas vezes só é eficaz para proteínas maiores, e a amostra mais importante deve estar dentro de uma temperatura e faixa de pH específicas. Amostras contendo as proteínas necessárias após 3000-5000 Daltons são difíceis de ler devido ao fato de a absorção ser muito baixa.
Ao contrário de outros testes de saúde, o teste de saúde de Bradford é menos sensível aos efeitos de vários compostos químicos, como sódio, potássio, também conhecido como sacarose semelhante a carboidrato, que pode estar presente nas quantidades necessárias para proteína. As exceções são concentrações mais altas de detergente.
Vários valores da amostra principal desconhecida podem ser usados para melhorar a precisão. Adicione 100 μl para fazer com o reagente de Bradford diluído a todos os poços. O acroissement total é de 200 μl / poço. Espere nos minutos mais baixos significativos, mas não mais do que 60 ou mais minutos, para que a cor se desenvolva.
